Repository of Research and Investigative Information

Repository of Research and Investigative Information

دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی زنجان

بررسی خصوصیات ایمنی‌زایی پروتئین نوترکیب زنجیره‌ی سبک سم بوتولینوم تیپ A(840)

(1386) بررسی خصوصیات ایمنی‌زایی پروتئین نوترکیب زنجیره‌ی سبک سم بوتولینوم تیپ A(840). مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات درماني استان زنجان.

[img] Text
J Adv Med -v15n59p21-fa.pdf

Download (326kB)

Official URL: http://zums.ac.ir/journal/browse.php?a_code=A-10-4...

Persian Abstract

چکیده زمینه و هدف: سم بوتولینوم تیپA به لحاظ ساختاری از یک زنجیره‌ی سبک به وزن50 کیلودالتون و یک زنجیره‌ی سنگین به وزن 100 کیلو‌دالتون تشکیل شده است که توسط یک باند دی‌سولفید به‌ هم متصل شده‌اند. این پروتئین شامل سه بخش (Domain) است که بخش زنجیره‌ی سبک آن دارای فعالیت آنزیمی می‌باشد. در این پژوهش، هدف ما از تولید نوترکیب بخش عملکردی به‌ دست آوردن یک پروتئین مناسب جهت بررسی ایمنی‌زایی آن است. روش بررسی: باکتری در شرایط بی‌هوازی رشد داده شد سپس DNA کروموزومی به روش قلیایی استخراج گردید. پس از بررسی ترادف ژن مربوطه و طراحی پرایمر قطعه‌ی مورد‌نظر از طریق واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمرازی(PCR) فراوان‌سازی شد. محصول PCR بر روی سه ناقل بیانی pRSETA ، pET28a و pET32aهمسانه‌سازی گردید. پروتئین حاصل از بیان توسطSDS-PAGE بررسی و صحت محصول با روش وسترن‌بلاتینگ و واکنش الیزا مورد‌تأیید نهایی قرار‌گرفت و سپس ‌به ‌وسیله‌ی کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص‌سازی شد، ایمنی‌زایی بر روی موش سوری در سه مرحله صورت گرفت و نتایج آن مورد بررسی قرار گرفت. یافته‌ها: در این تحقیق بالاترین بیان در شرایط غلظت 5/0 میلی‌مولار IPTG ، جذب نوری 6/0 و زمان القای 15 ساعت در دمای 30 درجه‌ی سانتی‌گراد به ‌دست آمد. پروتئین بیان شده توسط ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص‌سازی گردید. آنتی‌بادی حاصل از تزریق پروتئین نوترکیب توانست مانع از مرگ موش‌ها در دوز LD50 100 شود. نتیجه‌گیری: هر‌چند بیان ژن‌هایی با درصد بالایی از AT در سیستم Ecoli ضعیف می‌باشد ولی ما در این تحقیق توانستیم بیان مناسبی به‌ دست آوریم. تخلیص پروتئین نوترکیب در مراحل اولیه به دلیل اتصال ضعیف هیستیدین انتهایی به ستون دشوار بوده که با تغییر در روش‌ها این پروتئین تا 90 درصد خالص‌سازی شد. در بحث ایمنی‌زایی پروتئین نوترکیب مورد‌نظر نیز مشخص شد که آنتی‌بادی‌های تولید شده در مقایسه با آنتی‌بادی تولید شده علیه بخش اتصال‌دهنده از ایمنی‌زایی پایینی برخوردار است.

Title

Immunological Characterization of Light Chain Recombinant Protein of Clostridium botulinum Type A

Abstract

Background and Objective: Botulinum neurotoxin type A, structurally consists of a 50KD light chain and a 100 KD heavy chain linked by a disulfide bond. The protein can further be divided into three functional domains of which catalytic domain corresponds to the light chain. In this research we aimed to produce recombinant catalytic domain in order to obtain a protective protein. Materials and Methods: Bacteria were grown in anaerobic conditions and genomic DNA was extracted by alkaline method. Following the gene coding a set of primers was designed and the catalytic domain was amplified through PCR. The PCR product was then cloned into three expression vectors namely pRSETA, pET28a and pET32a. The expressed protein was analyzed on SDS-PAGE and confirmed by ELISA and western blotting and then purified by affinity chromatography. Results: In this research the maximum expression was obtained at 0.5 mM IPTG,OD600:0.6 and 15 hours of induction at 30˚C. The protein so expressed was purified by affinity coulmn chromatography .The antibody raised against recombinant protein could protect the rats by 100 LD50 . Discussion: Though the expression of AT- rich genes in E.coli system is low, we could obtain an appropriate level of expression in this study. The purification of recombinant protein in the early stages was elusive in the extreme by affinity chromatography due to the weak binding of histidine N-terminal to the column, howerer 90% purification was achieved through modification of the technique. The antibody produced against this domain was less protective compared to that of binding domain.

Item Type: Article
Keywords: Clostridium botulinum type A, Catalytic domain, PCR, Recombinant protein.
Journal or Publication Title: مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات درماني استان زنجان
Abstract and Indexing: ISC
Depositing User: خانم گیتی شاه محمدی
URI: http://repository.zums.ac.ir/id/eprint/4383

Actions (login required)

View Item View Item